EVALUASI VAKSIN IKAN


EVALUASI VAKSINASI

Uji tantang

Pada hari ke-15 setelah pemberian vaksin, dilakukan uji tantang selama 14 hari dengan cara menginfeksikan ikan uji dengan bakteri pathogen kepadatan tertentu yang telah ditingkatkan virulensinya dengan kaidah Koch’s Postulate. Penginfeksian bakteri dilakukan dengan metode penyuntikan sebanyak 0,1 ml pada bagian rongga perut (intraperitoneal). Pada masa uji tantang, ikan tetap diberi pakan dengan bobot 3% dari bobot biomassa.

 

Parameter yang dievaluasi

Tingkat Kelangsungan Hidup Ikan Uji

Tingkat kelangsungan hidup (Survival Rate) diamati pada masa pemeliharaan. Pengamatan parameter tersebut dilakukan setiap hari. Perhitungan parameter tingkat kelangsungan hidup menurut Effendie (1997) adalah :

                        SR       = x 100%

Di mana :

SR    = Survival Rate (%)

Nt      = Jumlah ikan yang hidup pada akhir pengamatan

No    = Jumlah ikan pada awal pengamatan

 

Relative percent survival (RPS)

RPS dihitung dengan rumus:

RPS = (1 – (% mortalitas divaksin / % mortalitas kontrol)) x 100

 

Indikator sistem kekebalan tubuh (data dukung: non-specific defence mechanism)

Penghitungan total leukosit, kadar hematokrit dan differential leucocyte dilakukan pada sebelum, akhir masa induksi dan pasca uji tantang.

Diferensial Leukosit

Pengamatan diferensial leukosit dilakukan sebanyak tiga kali sampling yaitu sebelum pemberian vaksin,  pasca pemberian dan pasca uji tantang. Pengamatan ini dilakukan untuk mengetahui perubahan jumlah total leukosit sehingga dapat mengetahui respon kekebalan tubuh ikan pasca pemberian vaksin dan pasca uji tantang. Pengamatan dilakukan terhadap sampel ikan sebanyak tiga ekor yang diambil dari setiap perlakuan dan setiap ulangan.

Leukosit yang dihitung pada penelitian ini adalah sel-sel darah limfosit, monosit, dan neutrofil. Dari 100 sel leukosit tersebut, dihitung berapa jumlah sel limfosit, monosit, dan neutrofil. Secara matematika, perhitungan deferensial leukosit menurut Kent and Thunet (1987) sebagai berikut :

:

L = Jumlah Sel Darah Putih Limfosit

M = Jumlah Sel Darah Putih Monosit

N = Jumlah Sel Darah Putih Neutrofil

L + M + N = 100 sel

L% + M% + N% = 100%

 Presentase Limfosit = x 100%

 Presentase Monosit = x 100%

 Presentase Neutrofil = x 100%

Indeks Fagositosis

Pengamatan Indeks Fagositosis dilakukan sebanyak tiga kali yaitu sebelum pemberian vaksin, pada saat pemberian vaksin dan pada saat uji tantang. Pengamatan pada saat perlakuan vaksin untuk mengetahui kemampuan sel-sel fagosit dalam melakukan mekanisme fagositosis, dan pengamatan pada saat uji tantang untuk mengetahui kemampuan leukosit dalam melakukan mekanisme fagositosis saat diinjeksi bakteri patogen. Aktivitas fagositik dilakukan berdasarkan persen (%) leukosit yang menfagosit dengan leukosit yang tidak memfagosit. Perhitungannya secara matematika menurut Anderson dan Siwicki (1993) adalah :

Indeks Fagositosis =  x 100%

  

Gejala klinis

Pengamatan dilakukan terhadap tingkah laku, gejala klinis dan mortalitas ikan uji yang dilakukan setiap hari hingga akhir masa pengujian. Ikan yang mati akan diperiksa penyebabnya, hanya ikan yang mati karena infeksi patogen target yang akan dihitung sebagai mortalitas kumulatif. Konfirmasi adanya infeksi pathogen target tersebut dilakukan melalui diagnosa presumtif dan dikonfirmasi secara laboratoris.

 

Kualitas Air

Parameter kualitas air yang diukur meliputi DO (Oksigen Terlarut), ammonia, suhu dan pH. Parameter ini diamati tiga kali selama masa penelitian yaitu pada hari ke-1, hari ke-14 dan hari ke-28. Selama penelitian berlangsung tidak ada penggantian dan penyiphonan air, yang ada hanya penambahan air jika ada pengurangan yang disebabkan penguapan.

 

Metode pengukuran titer antibodi

Agglutinasi bakteri (identifikasi jenis bakteri tertentu)

Prosedur kerja:

  1. Suspensi bakteri yang akan digunakan sebagai antigen sebaiknya memiliki kepekatan yang cukup tinggi – berwarna putih susu.
  2. Meneteskan suspensi bakteri di atas gelas objek pada masing-masing ujungnya (satu sebagai sampel yang akan diperiksa, dan satu lagi sebagai kontrol negatif). Diberi kode sederhana pada masing-masing tetesan untuk menghindari kekeliruan dalam membaca hasil uji.
  3. Menambahkan satu tetes antiserum (sebaiknya telah diencerkan 1:10) ke dalam salah satu tetesan bakteri yang akan diperiksa.
  4. Menambahkan pula satu tetes serum kontrol ke dalam salah satu tetesan bakteri yang lain yang akan digunakan sebagai kontrol negatif.
  5. Mencampurkan larutan pada glass obyek tersebut dengan cara menggoyang secara hati-hati namun pasti.
  6. Memeriksa proses agglutinasi (penggumpalan bakteri) yang terjadi secara makroskopis pada beberapa interval waktu pengamatan. Umumnya kalau bakteri yang diperiksa sejenis dengan antibodi yang digunakan, maka proses agglutinasi yang cukup kuat sudah terlihat setelah 5 menit kemudian.
  7. Hasil pengamatan dapat dikategorikan menjadi 5 yaitu: agglutinasi komplit (++++), agglunasi kuat (+++), agglutinasi sedang (++), agglutinasi lemah (+) dan tidak terjadi agglutinasi (-).

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Peralatan yang digunakan dalam uji ini, antara lain: ELISA plate reader, ELISA plate, Moist Chamber, multi repeater pipet 50-100ul, Mikropipet dan tip, botol squirt, inkubator, Erlenmeyer, kertas tissue, dan parafilm. Adapun bahan-bahan yang diperlukan meliputi: Coating buffer (Na2CO3  1.59 g dan NaHCO3 2.9 g larutkan dalam 1 liter akuadest pH  9.6), buffer pencuci dengan garam redah (LSW) (Trisma base 24.2 g, NaCl 222.2 g, Merthiolate 1 g dan Tween 20 5 ml dilarutkan dalam 1 liter akuades pH 7.3), Phophat Buffer Saline (PBS) (0.02 M phosphat, 0.15 NaCl pH 7.2 ditambah NaH22H2O sebanyak   0.876 g/l Na2HPO42H2O) sebanyak 2.56 g/l), buffer pencuci garam tinggi (HSW) (Trisma base 24.g/l, NaCl 292.2 g/l, merthilate 1 g/l dan Tween 20 sebanyak 10 ml/l pH 7.7), buffer antibodi (1 g BSA dalam 100 ml PBS), buffer substrat (Asam citrat 21.0 g/l, Sodium acetate 8.2 g/l pH 5.4, 5 ml H2O2 campur dengan 15 ml buffer substrat), buffer Conjugate (1 g BSA ditambah dengan 100 ml LSW), substrat (3’3’5’5′-Tetramethylbenidine dihydrochloride (TNB) 42mM ditambahkan kedalam campuran asam acetat dan akuades dengan perbandingan 1:2. Sebanyak 150 ml dari larutan ini ditambahkan ke dalam 15 ml buffer substrat), dan stop reagent (2 M H2SO4 dalam akuades).

Jika antigen berupa partikel (particulate antigen)

  1. Melapisi mikrotiter plate dengan menggunakan 50 ml poly-L-lysine pada 10 g/ml bicarbonat buffer.
  2. Inkubasi pada suhu ruang selama 30 menit
  3. Mencuci mikrotiter plate tersebut 3 kali dengan menggunakan LSW buffer
  4. Memasukkan bakteri/sampel yang akan diuji kedalam lubang plate tersebut sebanyak 100 ml pada kepadatan bakteri 108 sel/ml
  5. Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang
  6. Fiksasi bakteria pada lubang plate tersebut dengan menggunakan 50 ml larutan glutaraldehyde pada konsentrasi 1/1000 pada semua lubang pada plate
  7. Inkubasi pada suhu ruang selama 20 menit
  8. Cuci 3 kali dengan menggunakan buffer LSW
  9. Melakukan post-coat terhadap plate tersebut dengan menambahkan larutan post-coat sebanyak 250 ml untuk setiap lubang plate
  10. Inkubasikan semalam pada suhu 4oC (sebenarnya 30 menit sudah cukup, tapi lebih baik apabila diinkubasikan lebih lama. Tutup plate dengan parafilm.
  11. Cuci 3 kali dengan buffer LSW
  12. Memasukkan dengan pengenceran seri (disiapkan pada plate lain yang bersih dan mulai pada pengenceran 1/100 dalam PBS) serum pre immune pada lubang pada kolom ke 2.
  13. Menambahkan PBS saja pada lubang terakhir sebagi kontrol negatif.  Masukkan antibodi yang telah diencerkan dengan pengenceran seri ke dalam lubang kedua plate.
  14. Inkubasi plate pada suhu ruang selama 1 jam
  15. Cuci 5 kali dengan menggunakan HSW buffer. Pada pencucian terakhir biarkan direndam selama 5 menit.
  16. Memasukkan kedalam semua lubang plate yang mengandung sampel yang diuji tersebut 100 ml konjugat
  17. Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang
  18. Cuci lagi seperti pada tahap No. 15
  19. Menyiapkan substrat dan memasukkan substrat tersebut sebanyak 100 ml pada lubang yang mengandung sampel yang diuji.
  20. Inkubasikan selama 3-5 menit sampai terbentuk warna
  21. Stop reaksi dengan cara menambahkan 100 ml 2M H2SO4, dilakukan secara hati-hati.
  22. Baca absorbance pada panjang gelombang 450 nm (reaksi positif dengan ditunjukkan dengan adanya warna kuning).

Jika antigen solubel

  1. Melapisi mikrotiter dengan 50ml antigen solubel pada pada buffer bicarbonat (10 mg/ml) pada berbagai tahap pengenceran, tetapkan pada pH 9.6
  2. Inkubasi semalam pada suhu 4oC (untuk menghindari penguapan maka sebaiknya plate ditutup dengan parafilm)
  3. Cuci plate 3 kali dengan menggunakan buffer LSW
  4. Post coat dengan menggunakan larutan post coat (3% BSA dalam  H2O) sebanyak 250 ml untuk tiap lubang plate.
  5. Inkubasi selama minimum 30 menit pada suhu ruang
  6. Cuci  3 kali dengan menggunakan buffer LSW.
  7. Memasukkan antibodi kedalam masing-masing lubang plate kecuali lubang yang terakhir hanya diisi dengan PBS sebagai kontrol negatif.
  8. Inkubasi plate selama 1 jam pada suhu ruang.
  9. Cuci sebanyak 3 kali dengan menggunakan buffer HSW.
  10. Memasukkan 100 ml konjugat kedalam semua lubang plate  yang dipakai
  11. Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang
  12. Cuci seperti pada step No. 9
  13. Menyiapkan substrat
  14. Memasukkan substrat sebanyak 100 ml kedalam semua lubang plate yang diuji
  15. Inkubasi 5-10 menit sampai warna terbentuk
  16. Stop reaksi dengan menambahkan 100ml H2SO4  (lakukan dengan hati-hati)
  17. Baca absorbance pada 450 nm (positif sampel berwarna kuning)

Sandwich ELISA (untuk mengetahui spesifik patogen)

 

  1. Melapisi (coating) mikrotiter dengan 100 ml antibodi yang murni yang dilarutkan dalam buffer bicarbonas dengan konsentrasi 10 mg/l
  2. Inkubasi semalam pada suhu 4oC ( untuk menghindari penguapan tutup plate tersebut dengan parafilm)
  3. Cuci 3 kali dengan menggunakan buffer LSW
  4. Post-coat dengan larutan post coat sebanyak 250 ml untuk tiap lubang dalam plate
  5. Inkubasi selama minimal 30 menit pada suhu ruang
  6. Cuci 3 kali dengan menggunakan buffer LSW
  7. Menambahkan positif dan negatif kontrol dengan 3 ulangan , dengan volume 100 ml per lubang plate
  8. Menambahkan pula sampel dengan jumlah yang mencukupi dengan volume 100 ml per lubang plate
  9. Inkubasi selama satu jam pada suhu ruang
  10. Cuci 5 kali dengan menggunakan buffer HSW. Pada pencucian terakhir biarkan direndam selama 5 menit
  11. Memasukkan 100 ml antibodi cocktail ke dalam semua lubang pada plate
  12. Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang
  13. Cuci seperti pada step No. 10
  14. Memaasukkan 100 ml konjugat ke dalam semua lubang plate
  15. Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang
  16. Cuci seperti pada step No. 10
  17. Menyiapkan substrat
  18. Memaasukkan substrat sebanyak 100 ml ke dalam semua lubang pada plate
  19. Inkubasi selama 3 – 5 menit sampai warna timbul
  20. Stop reaksi dengan menambahkan 100 ml 2M H2SO4 (dilakukan secara hati-hati, karena mudah terbakar).
  21. Baca absorbance pada 450 nm (positif berwarna kuning).

Laju Pertumbuhan Spesifik

Laju pertumbuhan harian (Spesifik Growth Rate /SGR) dalam penelitian ini dihitung menggunakan rumus :                                  

Keterangan :

SGR = laju pertumbuhan harian (%)

Wt    = bobot rata-rata ikan pada saat akhir (gram)

W     = bobot rata-rata ikan pada saat awal (gram)

 t      = lama perlakuan (hari)

 

Laju Pertumbuhan Mutlak

Pertumbuhan ikan diukur setiap dua minggu sekali yakni pada hari ke 14 dan 28, misalnya. Pertumbuhan ikan dinyatakan sebagai selisih antara berat udang yang diukur pada akhir percobaan dengan berat ikan pada awal percobaan:

G = Wt – Wo

Di mana:

G= pertumbuhan (g)

 Wt= berat ikan pada waktu t (g)

Wo= berat ikan pada awal percobaan (g)

Konversi Pakan

Rumus untuk menghitung konversi pakan (Effendie 1979) yaitu:

Konversi pakan =   F/ (Wt+D)-Wo

Di mana:

F    = Jumlah pakan yang diberikan selama penelitian

Wo = Bobot rata-rata awal penelitian

Wt  = Bobot rata-rata akhir penelitian

D    = Jumlah bobot ikan yang mati selama penelitian

Iklan

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s